Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
30 сентября 2010 года

Дата введения:
с момента подписания

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ПОРЯДОК
ПРИМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
ПРИ ОБСЛЕДОВАНИИ ОЧАГОВ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ
С ГРУППОВОЙ ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬЮ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУК 4.2.2746-10

1. Методические указания разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол _____ от _______ 2010 года).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30 сентября 2010 года.

4. Введены в действие с 30 сентября 2010 года.

5. Введены впервые.

1. Область применения

1.1. В настоящих методических указаниях определены порядок применения молекулярно-генетических методов исследования, а также сбора, упаковки, хранения и транспортирования биологического материала и образцов объектов окружающей среды (ООС) при обследовании очагов острых кишечных инфекций с групповой заболеваемостью различной этиологии, вызванных ПБА III - IV группы, не относящимися к условно-патогенной флоре (УПФ).

1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы лечебно-профилактическими и другими учреждениями, независимо от ведомственной принадлежности и организационно-правовой формы.

2. Список сокращений

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения
ЖКТ желудочно-кишечный тракт
ОКИ острые кишечные инфекции
ООС объекты окружающей среды
ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ПБА патологические биологические агенты
ПЦР полимеразная цепная реакция
УПФ условно-патогенная флора
AFLP оценка полиморфизма длины фрагментов амплификации
EIEC энтероинвазивные E. coli
LCR лигазная цепная реакция
MLST мультилокусное секвенирование-типирование
NASBA метод изотермической амплификации РНК (Nucleic Acids Seaquencence Amplification)
PFGE электрофорез в пульсирующем поле
RAPD амплификации со случайными праймерами
VNTR амплификация тандемных повторов с переменной копийностью.

3. Общие положения

К молекулярно-генетическим методам исследования относятся методы выявления и характеристики инфекционных агентов на основе исследования их нуклеиновых кислот с применением или без применения амплификационных технологий путем определения наличия, размера и нуклеотидного состава различных элементов генома возбудителя либо сочетания этих подходов.

Наибольшее распространение получили амплификационные методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выявления ее продуктов применяются методы гель-электрофореза, гибридизации с флуоресцентно-мечеными зондами, гибридизационно-ферментное выявление продуктов ПЦР и способы детальной характеристики продукта с применением нуклеотидных биочипов и метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей продуктов реакции.

Достаточно широкое распространение имеют также методы анализа генома возбудителя без применения амплификационных технологий. Наиболее распространенным из них является метод электрофореза в пульсирующем поле.

Применение молекулярно-генетических методов исследования должно рассматриваться не как альтернатива, а как обязательное дополнение к регламентированным схемам диагностики острых кишечных инфекций, позволяющее эффективно выявлять комплекс вирусных возбудителей ОКИ и проводить оценку идентичности бактериальных и вирусных изолятов.

4. Организация исследований

4.1. Лабораторные исследования проводятся в соответствии с действующими нормативно-методическими документами.

4.2. Молекулярно-генетические методы исследования в очагах ОКИ с групповой заболеваемостью применяются для решения следующих задач:

- наиболее раннего установления этиологии заболеваний с целью своевременного начала адекватной терапии и проведения соответствующих санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий;

- выявления ДНК/РНК возбудителей в предполагаемых факторах передачи и источниках инфицирования;

- оценки идентичности изолятов возбудителей, выделенных из различных материалов с целью определения источников инфицирования и факторов передачи инфекции.

4.3. Применение молекулярно-генетических методов исследования является обязательным в случае исследования материала из очагов ОКИ с групповой заболеваемостью при:

- регистрации в очаге групповой заболеваемости ОКИ летальных исходов от данных заболеваний, в том числе установленной этиологии;

- отсутствии выделения от пациентов (> 30% обследованных) безусловных патогенов в сроки, регламентированные действующими нормативно-методическими документами;

- выделении от больных только условно-патогенной флоры в единичных случаях, без достоверно выявленного фактора передачи возбудителя;

- проведении детекции вирусных агентов в материалах из окружающей среды, продуктов питания или лиц - предполагаемых источников инфицирования;

- проведении оценки идентичности изолятов микроорганизмов, выявленных из различных источников и нерезультативном применении при этом комплекса классических микробиологических и серологических методик.

4.4. При работе в эпидемических очагах ОКИ количество обследуемых больных, лиц, подвергшихся риску заражения, декретированного контингента, образцов ООС и выделенных изолятов возбудителей определяется специалистами, уполномоченными осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор в соответствии с действующими нормативно-методическими документами.

4.5. Для обеспечения контроля качества проводимых исследований целесообразно дополнительно направлять на исследование клинический материал от лиц без клинических проявлений заболевания, не имеющих эпидемиологической связи с обследуемым очагом в количестве ~ 20% от пострадавших со вспышки в виде единой зашифрованной панели.

Клинический материал от лиц - предполагаемых источников инфицирования не подлежит зашифровке в целях правильной организации лабораторных исследований.

4.6. Первичное молекулярно-генетическое исследование (ПЦР-диагностика) клинического материала от больных проводится в лабораториях лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, имеющих в своем составе ПЦР-лаборатории.

4.7. Первичное молекулярно-генетическое исследование предполагаемых источников инфицирования, лиц, подвергшихся заражению, и ООС осуществляют на базе ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте Российской Федерации, имеющих в своем составе ПЦР-лаборатории.

4.8. Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней (региональные центры) Роспотребнадзора проводят исследования по оценке идентичности возбудителей, выявленных у пострадавших, лиц - предполагаемых источников инфицирования и ООС (при наличии необходимого оборудования и квалификации персонала), а также оказывают помощь ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации при исследовании больших объемов материала. Оценка идентичности культур микроорганизмов проводится только в отношении тех штаммов, которые были расценены как идентичные при проведении микробиологической диагностики.

При невозможности проведения работ по оценке идентичности изолятов в условиях региональных центров Роспотребнадзора, материал для данных исследований направляется в референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций (ФГУН "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Роспотребнадзора, 111123, г. Москва, ул. Новогиреевская, 3).

4.9. При получении отрицательных результатов первичного исследования клинического материала от больных и при получении дискордантных результатов исследований в региональных центрах, первичный клинический материал, образцы проб ООС и выделенные культуры возбудителей направляются для исследования в референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций.

4.10. Референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций оказывает информационно-методическую поддержку деятельности органов и учреждений Роспотребнадзора.

4.11. ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации ежемесячно представляют информацию об этиологической расшифровке очагов ОКИ с групповой заболеваемостью (от 5-ти случаев) в региональные центры по мониторингу за инфекционными и паразитарными болезнями (Приложение 2 без графы 12).

4.12. Региональные центры Роспотребнадзора ежеквартально (до 15-го числа следующего месяца) направляют информацию о результатах этиологической верификации очагов ОКИ с групповой заболеваемостью в референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций в разрезе курируемых территорий.

4.13. Референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций ежегодно (до 15-го марта следующего за отчетным года) направляет в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека отчет о регистрации и этиологической верификации очагов ОКИ с групповой заболеваемостью на территории Российской Федерации, а также рекомендации по совершенствованию применяемых при их расследовании методов лабораторной диагностики.

5. Правила сбора, хранения и транспортировки клинического
материала и образцов объектов окружающей среды

5.1. Сбор, хранение и транспортировка клинического материала и образцов ООС осуществляется в соответствии с действующими нормативно-методическими документами и инструкциями к используемым тест-системам.

5.2. Лабораторным исследованиям подлежат следующие материалы:

- клинический материал от пострадавших лиц, полученный в первые 72 часа от начала заболевания и не позднее 1 дня госпитализации (фекалии, взятые в объеме 2 - 5 мл, рвотные массы, по согласованию - мазки из ротоглотки и другие типы клинического материала);

- аутопсийный материал (фекалии, фрагменты стенки различных отделов ЖКТ);

- клинический материал от лиц - предполагаемых источников инфицирования (фекалии, взятые в объеме 2 - 5 мл, или ректальные мазки (Приложение 1), рвотные массы, по согласованию - образцы крови и другие типы клинического материала). Сбор ректальных мазков следует проводить только при невозможности получения фекалий в виде объемной пробы;

- образцы объектов окружающей среды (ООС), как предполагаемых факторов передачи заболевания. Объем выборки ООС (продукты питания, концентраты образцов воды) определяется специалистами, уполномоченными осуществлять государственный санитарно-эпидемиологический надзор. При исследовании продуктов питания обязательным является исследование смывов с их упаковок, поэтому продукты питания для исследования необходимо предоставлять в целой упаковке;

- культуры штаммов микроорганизмов, выделенных при проведении исследований клинического материала или ООС на транспортных средах.

5.3. Не допускается транспортировка клинического материала от больных и выделенных культур микроорганизмов в одном контейнере с образцами ООС и материалом от лиц - предполагаемых источников инфицирования.

5.4. В учреждении, осуществляющем первичное исследование материала, каждый образец клинического материала и ООС делится на две части, одна из которых подвергается исследованию, а другая хранится для обеспечения возможности ее исследования в региональном центре или референс-центре по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций.

6. Порядок проведения лабораторных исследований

6.1. Лабораторные исследования для установления этиологии заболеваний и выявления аналогичных возбудителей в ООС и лиц - предполагаемых источников инфицирования, организуемые на базе лабораторий ЛПУ, ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъектах Российской Федерации и Региональных центрах Роспотребнадзора, проводят с использованием диагностических тест-систем, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.

Для выявления патогенов методом ПЦР (ОТ-ПЦР) предпочтение должно отдаваться диагностическим тест-системам, которые обеспечивают максимальную контаминационную безопасность исследований (тест-системы с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, с возможностью использования деконтаминационных процедур на основе принципа пост-ПЦР стерилизации).

Референс-центр по мониторингу за возбудителями острых кишечных инфекций использует в своей работе весь доступный комплекс молекулярно-генетических методик.

6.2. Минимальный спектр исследований клинического материала от пострадавших при вспышках ОКИ должен включать детекцию:

- норовирусов 2 генотипа;

- ротавирусов группы A;

- микроорганизмов рода Shigella и энтероинвазивных E. coli (EIEC);

- микроорганизмов рода Salmonella;

- термофильной группы микроорганизмов рода Campylobacter.

Для детекции ротавирусов группы A в клиническом материале могут альтернативно применяться диагностические тест-системы на основе ИФА или латекс-агглютинации при наличии данных о их валидации относительно тест-систем, рекомендованных для использования ВОЗ.

Для детекции перечисленных групп бактериальных возбудителей обязательно параллельное применение бактериологической диагностики, проводимой в соответствии с действующими нормативно-методическими документами, с получением чистых культур возбудителей для возможного проведения впоследствии оценки их идентичности.

6.3. При неинформативности исследования на первичный спектр микроорганизмов или наличии дополнительных клинико-эпидемиологических данных в данный спектр исследований целесообразно включать возбудителей астровирусной инфекции, аденовирусной инфекции, тифо-паратифозных заболеваний, иерсиниозов, эшерихиозов.

При наличии клинико-эпидемиологических данных, не позволяющих исключить у пациента холеру, лабораторное исследование материала проводится в соответствии с действующими нормативно-методическими документами.

6.4. Лабораторное исследование материала от пострадавших на наличие возбудителей острых кишечных инфекций вирусной и бактериальной этиологии, вызванных ПБА III - IV группы, проводится в течение 24-х часов с момента его поступления в лабораторию. При поступлении в лабораторию большого количества образцов и невозможности их исследования в полном объеме, формируется репрезентативная выборка, исследование которой производится в вышеуказанные сроки, с последующим проведением полного объема исследований.

6.5. Лабораторные исследования по установлению идентичности изолятов микроорганизмов проводятся с применением молекулярно-генетических методик, обеспечивающих:

- необходимую для исследований разрешающую способность (способность дифференцировки штаммов микроорганизмов, циркулирующих на данной территории);

- межлабораторную воспроизводимость результатов исследований;

- низкий риск получения невалидных результатов исследования в комплексе с применением диагностических тест-систем.

6.6. В отношении возбудителей вирусной этиологии используются методы, основанные на прямом секвенировании вариабельного участка (участков) их генома. Для исключения получения ложноположительных результатов методом прямого секвенирования исследуются смещенные или альтернативные по отношению к используемым для диагностики области генома возбудителя. Предпочтение должно отдаваться методикам, позволяющим провести исследование возможно более протяженного участка генома возбудителя.

6.7. В отношении возбудителей бактериальной этиологии, используются методы, минимизирующие возможность субъективной оценки их результатов. Предпочтение должно отдаваться широко используемым в мире методикам, позволяющим провести сопоставление получаемых результатов с международными данными (мультилокусное секвенирование-типирование - MLST и его варианты, амплификация тандемных повторов с переменной копийностью - VNTR и его варианты, электрофорез в пульсирующем поле - PFGE, оценка полиморфизма длины фрагментов амплификации - AFLP). Желательно более широкое применение методик, основанных на прямом секвенировании участка (участков) генома возбудителя, как методик, обеспечивающих абсолютную воспроизводимость исследований.

Не рекомендуется применение методик, обладающих низкой межлабораторной воспроизводимостью - например амплификации со случайными праймерами (RAPD) или низкой дифференцирующей способностью.

6.8. При необходимости проведения одновременного исследования клинического материала от пострадавших и материалов с потенциально редким или низким содержанием возбудителя (ООС, предполагаемые источники инфицирования) придерживаются следующей последовательности выполнения работ:

1. Обработка материала и выделение нуклеиновых кислот (без проведения детекции патогенов) из образцов с потенциально редким или низким содержанием возбудителя (ООС, лица - предполагаемые источники инфицирования).

2. Обработка и исследование материала от пострадавших лиц и установление доминирующего возбудителя или доминирующих возбудителей.

3. Тестирование проб ООС и материала от лиц - предполагаемых источников инфицирования на наличие доминирующего патогена или патогенов.

При проведении лабораторной диагностики заболеваний данной группы следует учитывать возможную крайне высокую концентрацию их возбудителей в клиническом материале. Особенно характерным это является для ротавирусов и аденовирусов.

6.9. При проведении исследования продуктов питания на содержание ПБА наряду с самим продуктом исследуются смывы с его упаковки.

6.10. При тестировании материалов с потенциально редким или низким содержанием возбудителя с применением тест-систем на основе амплификационных технологий количество отрицательных контролей, прошедших все этапы исследований, должно составлять не менее 20% от количества исследуемых образцов.

6.11. По результатам проведенных исследований оформляется заключение, в котором должна быть представлена следующая информация:

- количество, характер поступивших на исследование образцов и их состояние после транспортировки (особое внимание должно уделяться состоянию целостности первичных контейнеров и упаковок продуктов питания);

- перечень использованных тест-систем;

- полученные результаты исследования.

При проведении исследования части образцов оформляется предварительное заключение, в котором дополнительно приводятся сведения о доле исследованных образцов.

6.12. В заключении, оформляемом по результатам оценки идентичности изолятов, должна быть представлена следующая информация:

- количество, состояние полученных культур микроорганизмов;

- краткое описание используемой методики, с указанием используемого оборудования и программного обеспечения, при использовании метода прямого секвенирования - размеров и расположения анализируемых участков генома;

- при использовании методик, результаты которых имеют форму паттернов (VNTR, AFLP, PFGE) - графическое представление полученных результатов.

6.13. Организации, ответственные за проведение данных разделов работы, сохраняют образцы клинического материала и ООС, культуры микроорганизмов и результаты исследований в виде первичных материалов (файлы, полученные на детектирующих приборах) до оформления окончательного донесения об очаге инфекционного заболевания с групповой заболеваемостью, а при проведении комиссионной судебной экспертизы в рамках уголовного дела - до истечения срока обжалования решения суда.

7. Нормативные ссылки

1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней" с дополнением СП 1.3.2518-09 от 02.06.2009 N 42.

2. СП 1.2.036-95 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I - IV групп патогенности".

3. МУ 1.3.1888-04 "Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III - IV групп патогенности".

4. МУК 4.2.2029-05 "Методические указания по санитарно-вирусологическому контролю водных объектов".

5. МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры".