Утверждаю Директор Федерального бюджетного учреждения науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
В.И.Покровский
11.11.2011

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

по применению набора реагентов

для выявления ДНК Legionella pneumophila в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

«АмплиСенс^® Legionellapneumophila-FL»

Вариант FEP

НАЗНАЧЕНИЕ.

Методические рекомендации описывают порядок действий при использовании набора реагентов для выявления ДНК Legionella pneumophila в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс^® Legionella pneumophila-FL» вариант FEP совместно с детекторами конечной флуоресценции «АЛА-1/4», а также детектором «Джин».

ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ НА ПРИБОРАХ РАЗЛИЧНЫХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ.

ВНИМАНИЕ! Предварительно следует провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно инструкции к набору реагентов.

В соответствии с маркой используемого амплификатора выбрать и запустить нужную программу (см. табл. 1а, 1б, 1в).

Когда температура в ячейках достигнет 95 °С (режим паузы), поместить пробирки в ячейки амплификатора (включая пробирки Фон), закрыть крышку прибора и продолжить программу, выполнив соответствующие манипуляции.

Рекомендуется перед постановкой в амплификатор осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием на вортексе (2-3 с).

По окончании выполнения программы амплификации приступить к детекции и анализу результатов.

Таблица 1а.

Программа для амплификаторов с активным регулированием (по объему раствора в пробирке):
«Терцик» («ДНК-Технология»), «GeneAmp PCR System 2400» («Applied Biosystems»):

Таблица 1б.

Программа для амплификаторов с активным регулированием (по объему раствора в пробирке):

«GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems»),
«Gradient Palm Cycler» («Corbett Research»), «Maxygene» («Axygen Scientific»):

Таблица 1в.

Программа для мплификаторов с регулированием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения не менее 1 °С/с):

«Uno-2» («Biometra») «MiniCycler», «PTC-100» («MJ Research»):

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ДЕТЕКЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР-ДЕТЕКТОРА «АЛА-1/4» («BioSan», Латвия).

Установка параметров теста «Legionella».

1. Запустить программу «ALA_1» на компьютере, присоединенном к прибору.

2. В главном меню программы выбрать «Настройки» → «Tест».

3. Нажать кнопку Новый (в верхнем правом углу).

4. В открывшемся меню задать название теста («Legionella»), нажать кнопку ОК.

5. В группе параметров Каналы отметить галочкой все задействованные в тесте каналы (FAM, HEX), в группе ВКО отметить канал, который используется для внутреннего контроля (FAM).

6. В полях п- и п+ установить пороговые значения для отношения сигнал/фон по каналу для детекции специфической ДНК:

HEX: «п-» = 3.0, «п+» = 4.0;

В поле ВКО/фон задать пороговое значение отношения сигнала по каналу для детекции ВКО к фону:

«ВКO/фон» = 2.0.

В группе параметров Уровень фона установить значения флуоресценции, указанны в программе по умолчанию.

7. Ввести название мишени в блок параметров Привязка каналов и соотнести его с каналами детекции. Для этого напечатать название мишени в свободное поле и нажать клавишу Добавить, при этом новая мишень появится в столбце уже существующих в памяти прибора мишеней. Название мишени в столбце Привязка каналов выделить курсором и нажать соответствующую ей кнопку канала для детекции:

Legionella = HEX

8. Блокировать функцию «Доверительный интервал», установив в поле Доверительный интервал, значение 555%.

9. Нажать кнопку Cохранить.

Проведение измерения флуоресцентного сигнала.

1. Включить прибор и запустить программу «ALA_1» на компьютере, присоединенном к прибору.

2. Задать протокол измерения. Для этого в главном меню выбрать «Протокол» → «Создать новый» или «Открыть», чтобы открыть созданный ранее протокол.

3. В окне протокола необходимо выбрать тип используемого ротора (36 х 0,5 или 48 х 0,2), ввести номер протокола, выбрать нужный тест («Legionella») в меню-вкладке «Тест» и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).

4. Обозначить образцы, которые являются фоновыми для данной группы образцов, как «фон» (используя сочетание клавиш «Ctrl» и «F»). В качестве образцов, обозначенных «ФОН» использовать пробирки с образцами «ФОН».

5. Закрыть окно редактирования протокола, нажав на кнопку Exit в верхнем левом углу панели. Протокол сохранить.

6. Поставить пробирки в ячейки ротора в соответствии с заданной последовательностью и запустить детекцию, выбрав в меню «Протокол» → «Детекция» или значок Детекция по протоколу на панели инструментов (вверху экрана).

Учет результатов.

1. Полученные данные интерпретируются автоматически с помощью программы «Ala_1». Результаты в таблице представляются с помощью следующих обозначений:

«обнаружено» – положительный результат;

«не обнаружено» – отрицательный результат;

«сомнительно» – результат, который нельзя однозначно интерпретировать (сигнал по каналу, отведенному для детекции специфической ДНК, превышает пороговое значение, допустимое для отрицательных образцов, но не превышает пороговое значение для положительных образцов (сигнал в так называемой «серой зоне»);

«нд» – недостоверный результат (в образце не детектируется (не превышает заданного порогового значения) ни специфический сигнал, ни сигнал ВКО).

2. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей выделения ДНК и амплификации (см. табл. 2.).

Таблица 2.

Результаты постановки контролей различных этапов ПЦР-анализа

3. Образцы, для которых получен результат «нд» (кроме К-), требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае если повторно получен результат «нд», требуется повторить анализ образца, начиная с этапа выделения. Для образца «K-» результат «нд» является нормой.

4. Образцы, для которых получен результат «сомнительно», требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае повторения аналогичного результата образцы считать положительными. При получении при повторной постановке отрицательного результата образец считать сомнительным и рекомендовать повторный забор материала для анализа.

5. Образец «ОК» должен давать отрицательный результат по каналу HEX и должен давать положительный результат по каналу FAM.

6. Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.

7. Если в отрицательном контроле (ОК или К-) детектируется положительный сигнал, значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ДЕТЕКЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ПЦР-ДЕТЕКТОРА «Джин».

Установка параметров теста «Legionella».

Детекция с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора «Джин» проводится согласно описанию в паспорте «Детектор полимеразной цепной реакции флуоресцентный Джин».

Для детекции и учета результатов используются следующие настройки:

тест «Legionella» - пороговые значения:

Legionella – HEX: «-» =3,0, «+»=4,0;

Внутренний контрольный образец – FAM: «ВК»=2,0.

Измерение флуоресцентного сигнала.

1. Включить прибор и запустить программу «Gene» на компьютере, присоединенном к прибору.

2. Задать протокол измерения. Ввести количество измеряемых образцов и количество фоновых пробирок (2), выбрать тест «Legionella» в графе «Тест», нажать кнопку «OK» (кнопкой мыши) и ввести последовательность детектируемых образцов (в колонке «Образец»).

3. В качестве образцов, обозначенных «ФОН» использовать пробирки с образцами «ФОН».

4. Поставить пробирки в ячейки модуля прибора «Джин» в соответствии с заданной последовательностью и запустить детекцию, нажав кнопку, обозначенную значком цветной призмы, в панели активных кнопок (вверху экрана). По окончании детекции первой группы, вынуть пробирки и заменить следующей группой пробирок и продолжить измерения, нажав кнопку «OK». По окончании детекции вынуть пробирки и нажать кнопку «OK».

Учет результатов.

1. Результат считается достоверным только в случае прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и отрицательного контроля выделения РНК (см. табл. 3).

Таблица 3.

Результаты постановки контролей ПЦР-анализа

2. Образцы, для которых получен отрицательный результат по всем каналам (кроме К-), требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае если данный результат получен повторно, требуется повторить анализ образца, начиная с этапа выделения. Для образца «K-» отрицательный результат по всем каналам является нормой.

3. Образцы, для которых ВК положительный, а значения специфического сигнала лежат в диапазоне значений выше отрицательного порога, но не превышают положительного порога для данного канала, требуют повторного проведения ПЦР и детекции. В случае повторения аналогичного результата образцы считать положительными. При получении при повторной постановке отрицательного результата образец считать сомнительным и рекомендовать повторный забор материала для анализа.

4. Отсутствие положительного сигнала в пробе с положительным контролем ПЦР может свидетельствовать о неправильно выбранной программе амплификации и о других ошибках, допущенных на этапе постановки ПЦР. В таком случае необходимо провести ПЦР еще раз.

5. Если в отрицательном контроле (ОК или К-) детектируется положительный сигнал, значит, произошла контаминация реактивов или проб. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ проб, а также предпринять меры по выявлению источника контаминации.

Лист вносимых изменений

Редакция	Место внесения изменений	Суть вносимых изменений
14.10.09	По тексту	Порядок амплификации, анализа и учета результатов перемещены в «Методическими Рекомендациями»
		Добавлен порядок проведения детекции результатов с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора «Джин»
	п. Проведение амплификации на приборах различных производителей	Изменена программа амплификации
	Порядок проведения детекции результатов с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора «АЛА-1/4»	В группе параметров Уровень фона удалены значения флуоресценции по каналам FAM и HEX
20.11.09	п. Учет результатов	п.2 В результатах постановки контролей для положительного контроля ПЦР ВКО- заменено на ВКО+
25.11.11 VV	Титульная страница	Добавлены подпись и печать директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии В.И. Покровского