Введение
Основным методом эпидемиологического надзора за энтеровирусами (HEV), наибольшее внимание в ходе которого уделяется вирусам полиомиелита, является вирусологическое исследование различных типов клинических образцов и объектов окружающей среды на линиях клеток RD и L20B c оценкой цитопатического эффекта и последующим типированием выявленных вирусных штаммов. Все вирусы полиомиелита, обнаруженные в ходе такого мониторинга, далее подвергают внутритиповой дифференциации – подтверждению/опровержению их вакцинного происхождения (Polio laboratory manual, 4th edition, 2004). По рекомендациям ВОЗ внутритиповую дифференциацию осуществляют двумя методами: серологическим (иммунно-ферментный анализ) и молекулярно-биологическим (ПЦР).
Несмотря на высокую информативность такого алгоритма исследования, он является трудоемким и обладает рядом характеристик, затрудняющих его применение на практике. Классическое вирусологическое исследование в культурах клеток является высокозатратным и занимает много времени, что делает его неудобным, особенно на этапе первичного скрининга большого количества исследуемых образцов. Также нежелательной для рутинной практики является электрофоретическая детекция продуктов ПЦР-амплификации в полиакриламидном геле, поскольку увеличивает опасность внутрилабораторной контаминации. Кроме того, существующая ПЦР-методика применима только для тестирования культуральной жидкости, то есть требует пассажа первичных образцов в чувствительной культуре клеток.
Целью данной работы, в связи с указанными причинами, явилось создание максимально адаптированной для практического применения тест-системы для выявления энтеро/полиовирусов и дифференцировки вакцинных штаммов полиовирусов допускающей ее непосредственное использование на клиническом материале или образцах окружающей среды без этапа культивирования. Удобство практического применения тест-системы должно обеспечиваться ее адаптацией к существующей материальной базе и квалификации персонала практических лабораторий, низкой трудоемкостью и контаминационной безопасностью.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы полиовирусов Sabin 1, 2 и 3 серотипов. Определение серотипа клинических изолятов энтеровирусов проводили методом прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей участка генома VP1.
Для проверки специфичности в отношении диких штаммов полиовирусов применяли положительные РНК контроли, представляющие синтезированные и клонированные в ms2 фаг нуклеотидные последовательности, идентичные последовательностям диких штаммов Mahoney, MEF, Saukett. Оценку аналитической чувствительности теста проводили с применением положительного контрольного образца ПКО Enterovirus-rec, представлявшего из себя генноинженерную конструкцию, содержавшую участок 5’нертанслируемой области HEV и gag HIV (1358-1564, HIVNL43) на тест-системе «AMPLICOR COBAS HIV-1 MONITOR TM TEST, version 1,5». Выделение РНК проводили методом сорбции на силикагеле с использованием набора «Рибо-Сорб» производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Для предупреждения появления ложнонегативных результатов исследования с этапа выделения нуклеиновых кислот использовали препарат внутреннего контрольного образца ВКО-STI-rec того же производителя.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора «Реверта-L» производства ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора. Реакцию амплификации проводили на амплификаторах Терцик («ДНК-технология») и GeneAmp-2700 (Applied Biosystems) с последующей детекцией продуктов амплификации на флуоресцентных детекторах «Джин» («ДНК-технология») и АЛА-1 («Биосан» Латвия). Амплификацию с детекцией продуктов в режиме реального времени проводили на приборах RotorGene 3000/6000 («Corbett Research», Австралия). Определение нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР проводился с использованием набора ABI PRISM Big Dyе (Applied Biosystems, USA), в соответствии с инструкцией изготовителя c использованием ABI-3100 PRISM Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA).
Основные результаты
Дизайн теста включал детекцию энтеровирусов (Entero-тест), детекцию комплекса полиовирусов и энтеровирусов группы С (Polio+HEVC-тест) и мультиплексную детекцию с дифференцировкой вакцинных штаммов полиовирусов (Sabin 1-2-3-тест).
Все тесты были разработаны в форматах гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов амплификации в режиме реального времени и по окончании реакции.
Детекцию энтеровирусов (Entero-тест) проводили амплификацией участка 5’-нетранслируемой области генома с применением оригинальных праймеров и зонда в формате TaqMan beacons.
Для выявления полиовирусов использовали методику амплификации участка 3’-нетранслируемой области генома, описанную Obreste et al. (2006) и дополненную применением оригинального зонда в формате TaqMan.
Для дифференцировки вакцинных штаммов полиовирусов (Sabin 1-2-3-тест) использовали праймеры, предложенные Yang et al. (1991), для амплификации участка области генома VP1 с дополнительным применением флуоресцентно-меченых зондов в формате TaqMan.
Специфичность теста для детекции энтеровирусов проверялась на штаммах энтеровирусов (Coxsakie B1, B2, B3, B4, B5, B6; Polio (Sabin) I, II, III), вирусов гриппа А (H13N2, H9N2, H8N4, H2N3, H4N6, H11N6, H12N5, H3N8, H1N1, H6N2, H10N7, H5N1), В, риновирусов, RS вирусов, аденовирусов человека - 3, 5, 7, 37, 40 типов. Штаммах N. meningitidis серогрупп А, В, С (35, 47 и 10 штаммов соответственно), выделенных от больных менингококковой инфекцией в 1990-96 гг. в Москве (60 штаммов) и Голландии (32 штамма), а также 39 образцов ДНК иных микроорганизмов, способных вызвать воспалительные процессы на оболочках головного мозга (по 1 штамму N. meningitidis серогрупп 29E, W135, X, Y, Z, N. cinereae, N. elongata, N. flavescens, N. gonorrhoeae, N. mucosa, N. sicca, N. subflava, Streptococcus pneumoniae, S. agalactiae, S. milleri, S. mitis, S. mutans, S. pyogenes, S. salivarius, S. sanguis, S. suis, S. viridans, Haemophilus influenzae, H. parainfluenzae, H. Haemolyticus (6 штаммов), Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus), полученные из коллекций ЦНИИ эпидемиологии, ГИСК им. Л.А.Тарасевича (г. Москва) и Нидерландской референтной лаборатории гнойных бактериальных менингитов.
Неспецифических реакций при тестировании данной панели с применением разработанных тестов выявлено не было.
При оценке специфичности Sabin 1-2-3-теста были также исследованы генноинженерные препараты, содержащие синтезированные и клонированные в ms2 фаг нуклеотидные последовательности VP1 участка генома, идентичные последовательностям диких штаммов полиовирусов. Перекрестных в отношении различных серотипов и неспецифических реакций выявлено не было.
Аналитическая чувствительность Entero-теста, определявшаяся с применением положительного контрольного образца ПКО Enterovirus-rec составила 2*103 ГЭ/мл. Тестирование вакцинных штаммов (Sabin 1-2-3) с применением Polio+HEVC- и Sabin 1-2-3 тестов показало аналогичную чувствительность. В рамках проведения внутрилабораторных испытаний разработанной методики было проведено тестирование образцов спинномозговой жидкости (СМЖ) и фекалий от пациентов с энтеровирусными менингитами, менингитами, вызванными вирусами паротита, гнойными менингитами, поражениями ЦНС неинфекционной патологии а также фекалии от пациентов с острыми кишечными инфекциями и вирусным гепатитом А. Количественная характеристика содержания энтеровирусов в СМЖ проведенная с применением количественно охарактеризованных калибраторов показала, что концентрация энтеровирусов в СМЖ у пациентов с серозными менингитами колеблется в диапазоне 1*103 – 1*105 ГЭ/мл и уверенно детектируется разработанной тест-системой. Концентрация энтеровирусов у данных пациентов в фекалиях гораздо выше и находится в диапазоне 1*105 – 1*109 ГЭ/мл. В СМЖ пациентов с гнойными менингитами и неинфекционными поражениями ЦНС положительных результатов при применении разработанного теста выявлено не было.
Заключение
Разработанная диагностическая тест-система позволяет избежать необходимости проведения вирусологических исследований на этапе первичного скрининга циркулирующих штаммов энтеро- и полиовирусов в различных типах клинического материала и объектах окружающей среды. Удобный и контаминационно-безопасный формат теста допускает его применение на коммерчески доступном оборудовании. Оптимальный алгоритм использования данного теста подразумевает детекцию энтеровирусов (Entero-тест) с последующим тестированием положительных образцов на тестах для выявления Polio + HEVC и Sabin 1-2-3. В разработанной тест-системе исключены методики для определения серотипа диких штаммов полиовирусов, поскольку на этапе именно первичного скрининга образцов проведение данных исследований представляется нецелесообразным.
При использовании указанного алгоритма возможно получение следующих вариантов ответов: отсутствие энтеровирусов в образце; обнаружение энтеровирусов групп А, В, С, D; обнаружение комплекса HEV C и полиовирусов; обнаружение вакцинных штаммов с дифференцировкой их серотипа.
Так же как и в методике, предложенной в «Polio laboratory manual, 4th edition, 2004» при использовании данного теста возможно совместное выявление с полиовирусами HEV C (для методики, рекомендуемой ВОЗ, вероятность их выявления составляет до 0,1%). Для прогностической оценки частоты выявления HEV С в комплексе с полиовирусами проанализирована частота обнаружения Coxsackie A вирусов в РФ в 2006г. На их долю по данным Федерального центра гигиены и эпидемиологии приходилось 0,6% выявленных энтеровирусов. Приблизительную оценку доли HEV С среди Coxsackie A вирусов было возможно провести только по данным зарубежных публикаций.
В соответствии с данными, представленными Центром контроля и профилактики заболеваний (MMWR Enterovirus Surveillance – United States, 1970-2005. September 15, 2006/ Vol. 55 / No. SS-8), среди Coxsackie A вирусов HEV C составляют 4,6%. Таким образом вероятность выявления данным тестом HEV С на практике будет составлять ~0,027%. Даже если доля выявляемых HEV С с учетом трудной культивируемости этих штаммов будет несколько выше, применение разработанного теста будет оправдано на этапе первичного скининга образцов.
